Przełom w detekcji sulfametoksazolu: test LFIA z czułością 6,8 ng/mL

Z tego artykułu dowiesz się:

Jak nowa metoda LFIA osiąga czułość wykrywania sulfametoksazolu na poziomie 6,8 ng/mL – znacznie niższym niż dotychczasowe testy terenowe
Jakie parametry charakteryzują przeciwciało monoklonalne o powinowactwie 2,65×10¹⁰ L/mol i dlaczego jest to przełom w immunodetekcji
W jaki sposób nanokompozyt Au/Ir@Zn/Cu-MOF łączy wysoką czułość z prostotą testu paskowego
Jak wyniki metody LFIA porównują się z chromatografią LC-MS w rzeczywistych próbkach żywności

Sulfametoksazol (SMX), syntetyczny antybiotyk sulfonamidowy stosowany powszechnie w weterynarii i akwakulturze, stanowi rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego. Jego nadmierne lub niewłaściwe użycie prowadzi do akumulacji w produktach spożywczych pochodzenia zwierzęcego, co może wywoływać reakcje alergiczne, oporność bakteryjną, neurotoksyczność oraz zaburzenia mikrobioty jelitowej. SMX klasyfikowany jest jako potencjalny kancerogen klasy III, a Unia Europejska ustaliła maksymalny dopuszczalny poziom pozostałości (MRL) na poziomie 100 μg/kg w tkankach jadalnych. Obecnie chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) pozostaje złotym standardem detekcji, jednak wymaga zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego i długiego czasu analizy. Alternatywne metody – takie jak ELISA, spektroskopia Ramana czy sensory elektrochemiczne – oferują szybszą detekcję, ale są ograniczone przez wieloetapowe procedury i skomplikowaną syntezę materiałów.

Jak połączyć wysoką czułość z prostotą testu terenowego?

Zespół z Fujian Agriculture and Forestry University postawił sobie za cel opracowanie lateral flow immunoassay (LFIA) – testu immunochromatograficznego – który łączyłby prostotę użycia z czułością porównywalną do metod laboratoryjnych. Kluczem do sukcesu było wytworzenie przeciwciała monoklonalnego o wysokim powinowactwie oraz zaprojektowanie wielofunkcyjnego nanoprobe’u Au/Ir@Zn/Cu-MOF. Ten hybrydowy nanomateriał integruje nanocząstki złota i irydu (Au/Ir) z metalorganicznymi strukturami szkieletowymi (MOF), co zapewnia zarówno wzmocnienie sygnału kolorymetrycznego, jak i stabilność koloidalną. Porowata struktura MOF umożliwia gęstą immobilizację przeciwciał i zapobiega agregacji nanocząstek, zachowując ich aktywność katalityczną.

Jak wysokie jest powinowactwo nowego przeciwciała?

Badacze zsyntetyzowali pełny antygen SMX-BSA metodą glutaraldehydową, łącząc hapten sulfametoksazolu z białkami nośnikowymi (BSA i KLH). Myszy BALB/c immunizowano antygenem SMX-BSA, a po czterech dawkach przypominających uzyskano miano przeciwciał sięgające 1,6×10⁴. Po fuzji komórek śledziony z linią szpikową SP2/0 wyizolowano klon hybrydowy 5D2, produkujący przeciwciało monoklonalne klasy IgG2a z łańcuchem lekkim kappa. Kluczowe parametry przeciwciała SMX-mAb:

Stała powinowactwa: 2,65×10¹⁰ L/mol – wartość wskazująca na bardzo silne wiązanie z antygenem
Miano: >8×10³ po oczyszczeniu chromatografią powinowactwa na białku G
IC50 w icELISA: 1,867 μg/mL przy optymalnych stężeniach przeciwciała i antygenu
Brak reaktywności krzyżowej z pokrewnymi sulfonamidami (sulfatiazol, sulfamerazyna, sulfadimetoksyna, sulfametazyna)

Analiza chromosomalna potwierdziła udaną fuzję – linia komórkowa 5D2 posiadała 106±3 chromosomy. Elektroforeza SDS-PAGE wykazała obecność charakterystycznych pasm odpowiadających ciężkiemu (50 kDa) i lekkiemu (25 kDa) łańcuchowi przeciwciała.

Kluczowe: Przeciwciało monoklonalne SMX-mAb wykazało wyjątkowo wysoką stałą powinowactwa (2,65×10¹⁰ L/mol) i utrzymało pełną stabilność immunoreaktywności przez co najmniej 12 miesięcy przy przechowywaniu w 4°C, nawet po rozcieńczeniu 1:1000 (OD450 nm >3).

Jak SMX wiąże się z przeciwciałem na poziomie molekularnym?

Aby zrozumieć mechanizm rozpoznawania antygenu, przeprowadzono dokowanie molekularne i symulacje dynamiki molekularnej (MD). Strukturę 3D przeciwciała SMX-mAb uzyskano metodą modelowania homologicznego na podstawie sekwencji genowej. Wyniki pokazały, że sulfametoksazol wiąże się w regionie CDR (complementarity-determining region) ciężkiego łańcucha przeciwciała poprzez:

Wiązanie wodorowe z Ala33
Oddziaływania hydrofobowe z Tyr32, Tyr101 i Asp103
Interakcję π-anion z Asp103

Podczas 100-nanosekundowej symulacji MD, wartość RMSD (root-mean-square deviation) stopniowo wzrastała i ustabilizowała się po około 58 ns, co wskazuje na osiągnięcie równowagi układu. Promień żyracji (Rg) wykazywał niewielkie wahania, sugerując lokalne dostosowania konformacyjne bez utraty globalnej integralności strukturalnej. Analiza wiązań wodorowych ujawniła dynamiczne fluktuacje, ze średnią trzech wiązań wodorowych utrzymywanych w późniejszych etapach symulacji. Energia wiązania wynosząca -14,56±1,09 kcal/mol (metoda MM-PBSA) potwierdza stabilne oddziaływanie, a dekompozycja energetyczna wskazała, że Tyr32 wnosi największy wkład (-2,95 kcal/mol) do wiązania ligandu.

Co wyróżnia nanokompozyt Au/Ir@Zn/Cu-MOF?

Nanoprobę Au/Ir@Zn/Cu-MOF zsyntetyzowano metodą współstrącania. Nanocząstki Au/Ir uzyskano zmodyfikowaną metodą redukcji cytrynianowej – do wrzącej mieszaniny wody z cytrynianem trisodowym dodano HAuCl₄ i IrCl₃·xH₂O, co spowodowało zmianę koloru na ciemnoniebieską, wskazującą na utworzenie nanocząstek. Następnie nanocząstki włączono do struktury metalorganicznej (MOF) składającej się z cynku, miedzi i 2-imidazolokarboaldehydu (2-ICA). Kluczowe cechy nanoprobe’u:

Wzrost średnicy hydrodynamicznej: z 10,10 nm (Au/Ir NPs) do 105,71 nm (Au/Ir@Zn/Cu-MOF) i 122,42 nm po koniugacji z przeciwciałem
Zmiana potencjału zeta: z -9,7 mV (Au/Ir NPs) poprzez -25,01 mV (Au/Ir@Zn/Cu-MOF) do -16,17 mV (Au/Ir@Zn/Cu-MOF-mAb)
Przesunięcie batochromowe w spektrach UV-Vis potwierdzające modyfikację powierzchni i koniugację z przeciwciałem
Obecność Au, Ir, Zn i Cu potwierdzona spektroskopią dyspersji energii (EDS)

Mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM) wykazała, że nanocząstki Au/Ir są równomiernie rozmieszczone w strukturze Zn/Cu-MOF, co zapobiega ich agregacji i zachowuje aktywność katalityczną podobną do peroksydazy. Porowata struktura MOF umożliwia wysoką gęstość immobilizacji przeciwciał przy jednoczesnym zachowaniu stabilności koloidalnej.

Jak działa test immunochromatograficzny LFIA?

Test LFIA opiera się na zasadzie konkurencji immunologicznej: sulfametoksazol obecny w próbce konkuruje z antygenem SMX-BSA unieruchomionym na linii testowej (T) o wiązanie z przeciwciałem monoklonalnym sprzężonym z nanoprobą Au/Ir@Zn/Cu-MOF. Linia kontrolna (C) pokryta jest kozim przeciwciałem anty-mysim IgG, które wiąże nadmiar probe’u i potwierdza prawidłowość testu. Wyższe stężenie SMX w próbce powoduje słabsze zabarwienie linii testowej.

Parametry testu zoptymalizowano następująco:

Stężenie koziej anty-mysiej IgG na linii C: 1 mg/mL
Stężenie antygenu powlekającego na linii T: 150 μg/mL
Objętość nanoprobe’u: 2 μL na pasek

W warunkach optymalnych intensywność linii T malała wraz ze wzrostem stężenia SMX, a wizualne zanikanie linii T obserwowano przy 50 μg/mL – to wizualny limit wykrywalności (vLOD). Krzywa standardowa wykazała silną korelację liniową (R²=0,992), z IC50 wynoszącym 565,84 ng/mL i liniowym zakresem detekcji od 6,8 ng/mL do 47,06 μg/mL.

Ważne: Test LFIA osiągnął limit wykrywalności 6,8 ng/mL – wartość znacznie niższą niż większość dostępnych testów terenowych, przy zachowaniu prostoty użycia i możliwości odczytu wizualnego już przy 50 μg/mL.

Czy metoda sprawdza się w rzeczywistych próbkach żywności?

Badacze ocenili specyficzność testu, testując cztery strukturalnie pokrewne sulfonamidy (sulfatiazol, sulfamerazyna, sulfadimetoksyna, sulfametazyna) w stężeniu 50 μg/mL. Nie zaobserwowano żadnej wykrywalnej interferencji sygnału ani reaktywności krzyżowej, co potwierdza doskonałą specyficzność przeciwciała SMX-mAb.

Stabilność nanoprobe’u i pasków testowych oceniano podczas przechowywania w 4°C i 25°C (wilgotność względna <30%). Spektra UV-Vis Au/Ir@Cu/Zn-MOF-mAb wykazały znikome zmiany w różnych temperaturach i punktach czasowych, wskazując na dobrą stabilność fizykochemiczną. Sygnały gęstości optycznej mierzone czytnikiem paskowym pozostawały zasadniczo niezmienione przez cały okres przechowywania, a wizualna inspekcja rozwoju linii potwierdziła stabilną wydajność pasków przez co najmniej jeden miesiąc.

Wykonalność metody LFIA oceniono w sześciu powszechnych matrycach żywnościowych: wołowina, wieprzowina, węgorz, okoń morski, mleko i jajko. Próbki wzbogacono SMX w stężeniu 50 μg/mL jako kontrolę dodatnią, podczas gdy PBS służył jako kontrola ujemna. Nie wykryto pozostałości SMX w żadnej z komercyjnych próbek żywności. Analiza ilościowa przy użyciu czytnika paskowego wykazała wyraźne różnice w stosunkach T/C między próbkami nietraktowanymi i wzbogaconymi.

Jak metoda LFIA wypada w porównaniu z LC-MS?

Aby ocenić dokładność, przeprowadzono badania odzysku i porównano wyniki z analizą LC-MS. LFIA osiągnęła współczynniki odzysku w zakresie 97,92–108%, ze współczynnikami zmienności (CV) poniżej 11,17%. Wyniki te ściśle odpowiadały wynikom LC-MS, potwierdzając niezawodność i dokładność opracowanej metody LFIA do wykrywania SMX w próbkach żywności.

Przykładowe wyniki odzysku dla wybranych matryc:

Wołowina (50 μg/mL): odzysk 100,18±1,00%, CV 1,00%
Węgorz (3,125 μg/mL): odzysk 99,84±3,41%, CV 3,42%
Jajko (0,1 μg/mL): odzysk 98,4±8,68%, CV 8,82%

Analiza efektów matrycowych wykazała minimalne zakłócenia sygnału, co potwierdza, że metoda może być stosowana bezpośrednio w złożonych matrycach żywnościowych po odpowiednim przygotowaniu próbki (ekstrakcja EDTA-McIlvaine, wirowanie, filtracja przez filtry 0,45 μm).

Czy test LFIA może zmienić monitoring SMX w żywności?

Opracowana metoda LFIA oparta na nanocząsteczkach Au/Ir@Zn/Cu-MOF i przeciwciele monoklonalnym o wysokim powinowactwie stanowi znaczący postęp w terenowej detekcji sulfametoksazolu. Osiągnięty limit wykrywania 6,8 ng/mL – znacznie niższy niż w większości dostępnych testów terenowych – przy zachowaniu prostoty użycia i możliwości wizualnego odczytu, czyni tę metodę obiecującym narzędziem do rutynowego monitoringu pozostałości antybiotyków w produktach pochodzenia zwierzęcego. Doskonała specyficzność, brak reaktywności krzyżowej oraz zgodność wyników z metodą LC-MS potwierdzają niezawodność platformy. Stabilność przez co najmniej miesiąc w temperaturze pokojowej i minimalne efekty matrycowe zwiększają praktyczną użyteczność metody w warunkach terenowych, gdzie szybka detekcja jest kluczowa dla zapewnienia bezpieczeństwa żywności i przeciwdziałania oporności bakteryjnej.

Pytania i odpowiedzi

❓ Jaka jest czułość nowej metody LFIA w porównaniu do LC-MS?

Metoda LFIA osiąga limit wykrywalności 6,8 ng/mL z IC50 równym 565,84 ng/mL, co stanowi znaczący postęp w porównaniu do większości dostępnych testów terenowych. Wyniki odzysku (97,92–108%) ściśle odpowiadają wynikom LC-MS, potwierdzając, że nowa metoda łączy dokładność laboratoryjną z prostotą testu paskowego. Dodatkowo wizualny limit wykrywania wynosi 50 μg/mL, co pozwala na szybką ocenę bez użycia czytnika.

❓ Czy test wykazuje reaktywność krzyżową z innymi sulfonamidami?

Nie. Przeciwciało monoklonalne SMX-mAb wykazało doskonałą specyficzność bez wykrywalnej reaktywności krzyżowej z czterema strukturalnie pokrewnymi sulfonamidami: sulfatiazolem, sulfamerazyną, sulfadimetoksyną i sulfametazyną, testowanymi w stężeniu 50 μg/mL. To potwierdza, że metoda jest wysoce swoista dla sulfametoksazolu i nie daje wyników fałszywie dodatnich przy obecności innych antybiotyków z tej grupy.

❓ Jak długo test zachowuje stabilność podczas przechowywania?

Zarówno nanoproba Au/Ir@Cu/Zn-MOF-mAb, jak i gotowe paski testowe wykazują doskonałą stabilność przez co najmniej miesiąc przy przechowywaniu w temperaturze 4°C i 25°C (wilgotność względna <30%). Spektra UV-Vis i sygnały gęstości optycznej pozostają niezmienione w czasie, a przeciwciało monoklonalne utrzymuje pełną immunoreaktywność przez 12 miesięcy, nawet po rozcieńczeniu 1:1000. To czyni metodę praktyczną w zastosowaniach terenowych.

❓ W jakich produktach spożywczych zwalidowano metodę?

Metodę LFIA przetestowano w sześciu powszechnych matrycach żywnościowych: wołowinie, wieprzowinie, węgorzu, okoniach morskich, mleku i jajkach. Analiza efektów matrycowych wykazała minimalne zakłócenia sygnału, a współczynniki odzysku w zakresie 97,92–108% z CV <11,17% potwierdzają, że test może być stosowany bezpośrednio w złożonych matrycach po standardowym przygotowaniu próbki. W żadnej z komercyjnych próbek nie wykryto pozostałości SMX.

❓ Jakie są główne zalety nanokompozytu Au/Ir@Zn/Cu-MOF?

Nanokompozyt łączy właściwości katalityczne nanocząstek Au/Ir (aktywność podobna do peroksydazy, wzmocnienie sygnału kolorymetrycznego) z zaletami metalorganicznych struktur szkieletowych MOF (porowatość, wysoka gęstość immobilizacji przeciwciał, zapobieganie agregacji). Średnica hydrodynamiczna wzrasta z 10,10 nm do 122,42 nm po koniugacji z przeciwciałem, co potwierdza skuteczną funkcjonalizację. Struktura zapewnia stabilność koloidalną i zachowanie aktywności katalitycznej w czasie.